Acute blootstelling aan een traumatische gebeurtenis is een directe oorzaak van posttraumatische stressstoornis (PTSS). Het wordt gesuggereerd dat de amygdala geassocieerd is met de ontwikkeling van PTSS. In onze eerdere bevindingen werden verschillende activatiepatronen van GABAerge neuronen en glutamaterge neuronen gevonden in de vroege of late stadia na stress. Echter, het neurale plastische mechanisme dat ten grondslag ligt aan de rol van de basolaterale amygdala (BLA) bij posttraumatische stressstoornis blijft onduidelijk. Daarom richtte deze studie zich voornamelijk op het onderzoeken van tijdsafhankelijke morfologische en elektrofysiologische veranderingen in de BLA tijdens de ontwikkeling van PTSS. We gebruikten de procedure van enkelvoudige langdurige stress (SPS) om een PTSS-model bij ratten op te zetten. De ratten vertoonden geen veranderingen in angstgedrag evenals in dendritische werveldichtheid of synaptische transmissie in de BLA één dag na SPS. Echter, 10 dagen na SPS vertoonden ratten een toename van angstgedrag, en werveldichtheid en frequentie van miniature excitatoire en inhibitoire postsynaptische stromen in de BLA. Onze resultaten suggereren dat na traumatische stress de BLA een vertraagde toename vertoonde in zowel spinogenese als synaptische transmissie, wat de ontwikkeling van PTSS leek te faciliteren.
Als een complexe angststoornis komt posttraumatische stressstoornis (PTSS) over het algemeen voor na blootstelling aan traumatische stress. PTSS heeft wereldwijd een hoge prevalentie en legt een zware last op gezinnen en de samenleving. Het model van enkelvoudige langdurige stress (SPS), een geschikt diermodel voor PTSS, is opgezet om de neurobiologische mechanismen van PTSS te onderzoeken gezien de beperkingen van menselijke studies. Ratten vertoonden abnormaal gedrag en disfunctie van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA)-as na SPS, wat een verondersteld neuro-endocrinologisch kenmerk is van PTSS. Het SPS-paradigma bestaat uit de volgende procedures: beperking, gedwongen zwemmen in water bij 20–24°C, blootstelling aan ether, en ongestoord verblijf in de kooi gedurende 7 dagen, wat essentieel is voor de ontwikkeling van belangrijke symptomen van PTSS. Dit model kan de symptomen van PTSS bij mensen nabootsen, met gedragsveranderingen waaronder verhoogde angst, verminderde sociale interactie en ruimtelijk geheugen.
De amygdala, betrokken bij de regulatie van angst en geheugen, bevindt zich in het limbisch systeem van de hersenen en bestaat uit verschillende subregio's, zoals de corticomediale nucleus, basolaterale nucleus (BLA), en centrale nucleus. Pyramidevormige neuronen vormen ongeveer 85% van alle neuronen in de volwassen BLA, en de rest zijn voornamelijk interneuronen. Het is gesuggereerd dat dysfunctie van de amygdala geassocieerd is met de pathogenese van psychische stoornissen, zoals depressie, angst en autisme. Klinisch onderzoek naar PTSS heeft onthuld dat de reactie van de amygdala bij patiënten op emotionele stimuli overdreven was. Een reeks moleculaire substraten in de amygdala is geïmpliceerd in het gedrag geassocieerd met PTSS, zoals de glucocorticoïdreceptor, beta-arrestin-2, β-adrenoreceptor, en mTOR-signaalroute. Onlangs hebben we ook verschillende activeringspatronen van glutamaterge en GABAerge neuronen in de amygdala gevonden, met name een vertraagde versterking van de activering van glutamaterge piramidale neuronen in de BLA. Er zijn echter minder studies die laten zien hoe de synaptische plasticiteit in de BLA verandert in het diermodel van PTSS.
Stel je voor dat de hersenen als een netwerk van verbindingen werken, en dendrieten en dendritische wervels zijn als bouwstenen in dat netwerk. Deze structuren spelen een cruciale rol bij hoe onze hersenen informatie verwerken en opslaan, vooral als het gaat om leren en geheugen.
De amygdala is een specifiek deel van de hersenen dat betrokken is bij emoties, inclusief stressreacties. Wanneer we stress ervaren, kunnen er veranderingen optreden in de structuur van de dendrieten en wervels in de amygdala. Dit is interessant omdat het suggereert dat stress invloed kan hebben op hoe ons brein is bedraad.
In het specifieke onderzoek waar we naar kijken, hebben ze ontdekt dat bij ratten die stress hebben ervaren, er meer dendritische wervels zijn in een bepaald deel van de amygdala (BLA genaamd). Deze wervels kunnen worden ingedeeld op basis van hun vorm (stomp, dun, paddenstoel), en deze vormen hebben verschillende functies in hoe informatie wordt overgedragen.
Nu, de onderzoekers speculeren dat de toename van deze wervels kan worden geassocieerd met een toename van synaptische activiteit. Synapsen zijn de verbindingen tussen neuronen waar informatie wordt overgedragen, en als er meer wervels zijn, kan dit betekenen dat er meer van deze verbindingen actief zijn.
Om het simpel te zeggen, stress lijkt de structuur van bepaalde delen van de hersenen te veranderen, wat kan leiden tot meer actieve verbindingen tussen neuronen. Deze veranderingen kunnen van invloed zijn op hoe we reageren op stress en hoe we informatie verwerken.
Proefpersonen
Sprague-Dawley ratten (3 maanden oud, mannelijk), met een gewicht van 220-260 g, werden verkregen van het Laboratorium Dierencentrum, Gezondheidswetenschappen van de Universiteit van Peking. De ratten werden in groepen van vijf gehouden bij een temperatuur van 23 ± 2°C en een luchtvochtigheid van 50 ± 5%, met vrije toegang tot water en voedsel onder een cyclus van 12 uur licht en 12 uur donker. We voerden alle gedragsexperimenten uit tijdens de donkere fase. Dierenverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Biomedische Ethische Commissie van de Universiteit van Peking.
Single Prolonged Stress
Single prolonged stress (SPS) is een algemeen erkend PTSS-model (Ding et al., 2010), dat krachtige reacties op stress teweegbrengt via psychologische (beperking), fysiologische (gedwongen zwemmen) en farmacologische (blootstelling aan ether) paden. De SPS-procedure werd uitgevoerd op basis van een eerdere studie (Fang et al., 2018), inclusief 2 uur beperking, 20 minuten gedwongen zwemmen, herstel in de thuiskooi gedurende 15 minuten, en blootstelling aan diëthylether tot een kort bewustzijnsverlies. Op dezelfde dag van de SPS-behandeling werden de controledieren behandeld. Alle dieren werden gedurende 10 dagen ongestoord in hun thuiskooien gelaten voordat de sensibilisatietest werd uitgevoerd (Liberzon et al., 1997).
Open Veld Test
Het apparaat voor de open veld test (OFT) had een vierkante arena van 75 × 75 × 40 cm en was verdeeld in 25 gelijke vakjes van 15 × 15 cm (Xue et al., 2015; Fang et al., 2018). Het apparaat werd verlicht op 10 lux. Handdoeken gedrenkt in 75% ethanol werden gebruikt om het apparaat op te ruimen en de geur van de vorige rat af te vegen na elke run van 5 minuten. Een rat werd in het midden van het apparaat geplaatst, en zijn bewegingen werden opgenomen door een digitale videocamera gemonteerd op het dak en aangesloten op een computer. Met behulp van een EthoVision System XT 10.1 (Noldus Information Technology, Nederland) werd de tijd besteed in het centrale deel van het apparaat geanalyseerd.
Verhoogd Kruismodel
De verhoogde kruistest (EPM) werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Xue et al., 2015; Fang et al., 2018). Twee open armen (50 × 10 cm), en twee gesloten armen (50 × 10 × 40 cm), evenals een middelste compartiment (10 × 10 cm), vormden de vorm van een kruis, dat 70 cm boven de grond werd geplaatst. Elke rat verkende het apparaat ad libitum gedurende 5 minuten nadat hij in het middelste compartiment was geplaatst met het hoofd naar een open arm gericht. Handdoeken gedrenkt in 75% ethanol werden gebruikt om het apparaat op te ruimen en de geur van de vorige rat af te vegen na elke run. De beweging van ratten werd opgenomen met een videocamera gemonteerd op het dak en aangesloten op een computer. De test werd uitgevoerd met een verlichtingsniveau van 3 lx in de gesloten armen en 8 lx in de open armen (Suo et al., 2013). Met behulp van een EthoVision System XT 10.1 (Noldus Information Technology, Nederland) werden het aantal toegangen tot de open armen en de tijd besteed (in seconden) in de open armen geanalyseerd.
Slice-voorbereiding
De hersenen werden snel verwijderd nadat ratten waren verdoofd en vervolgens onthoofd. De hersenen werden onmiddellijk geplaatst in snijoplossing (in mM) bij 0-4°C: 87 NaCl, 3,0 KCl, 1,5 CaCl2, 1,3 MgCl2, 1,0 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 20 d-glucose en 75 sucrose, verzadigd met 95% O2 en 5% CO2 om 250 μm dikke coronale secties te verkrijgen met een vibratoom (Leica VT1000 S). Dwarse plakjes bevattende de BLA werden gesneden en overgebracht naar een houdkamer met ACSF (in mM): 124 NaCl, 3,0 KCl, 1,5 CaCl2, 1,3 MgCl2, 1,0 NaH2PO4, 26 NaHCO3 en 20 d-glucose, verzadigd met 95% O2 en 5% CO2 bij 33°C gedurende 30 minuten en vervolgens op kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten totdat ze werden gebruikt voor opnames.
Whole-Cell Patch-Clamp Recording
Neuronen met duidelijke primaire dendrieten en uitsteeksels werden geselecteerd, wat de morfologische kenmerken zijn van BLA-hoofdneuronen (McDonald, 1982; Padival et al., 2013). Pipetten voor de hele-cel patch-clamp waren gemaakt van borosilicaatglas capillairen (buitendiameter 1,5 mm; World Precision Instruments, Sarasota, FL, Verenigde Staten). De weerstanden van de elektroden varieerden van 2 tot 3,5 MΩ. Voltages werden gecorrigeerd voor een vloeistofknooppotentieel van 13–14 mV, berekend met pClamp 10.3. Opnames werden uitgevoerd bij 32–33°C, met stabiele perfusie van ACSF (2 ml/min). Elektroden waren gevuld met (in mM): 110 Cs methylsulfaat, 0,3 Tris-GTP, 15 CsCl, 2 MgCl2, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 4 QX-314 en 5 Na2-fosfocreatine (pH 7,15–7,25 met CsOH, 270–280 mOsm met sucrose). Om miniature synaptische gebeurtenissen (mEPSC's en mIPSC's) op te nemen, baadden we de plakjes in normale ACSF met 1,0 μM TTX. Na 5 minuten stabilisatie na doorbraak werden mEPSC's en mIPSC's opgenomen bij een houdpotentiaal van −70 mV gedurende 2 minuten en bij 0 mV gedurende 2 minuten, respectievelijk (Lippi et al., 2016; Nagode et al., 2017). De postsynaptische stromen opgenomen bij −70 mV werden geblokkeerd na toevoeging van 20 μM CNQX en 50 μM AP5, terwijl die opgenomen bij 0 mV werden geblokkeerd door 50 μM picrotoxine (Supplementaire figuur S1). De serie weerstand werd voortdurend bewaakt. De celingangsweerstand (Rin) werd berekend door de stroomrespons te bepalen vanaf een houdpotentiaal van −70 mV naar de stappen van −5 mV hyperpolarisatie (Mizunuma et al., 2014; Nagode et al., 2017). Gegevens werden uitgesloten wanneer de serie weerstand boven 16 MΩ kwam of de verandering van serie weerstand meer dan 20% bedroeg. In deze studie vertegenwoordigt de stijgtijd 10–90% stijgtijd, en de afbraakkinetiek werd gemeten als 90–37% afbraaktijd. Het totale aantal gebeurtenissen dat zich voordeed tijdens opnamen van 2 minuten werd geanalyseerd. Het aantal mEPSC's dat voor elke cel in de analyse werd gebruikt, varieerde van 109 tot 942, en het aantal mIPSC's varieerde van 55 tot 899. Eerdere studies toonden aan dat de mEPSC-stijgtijd variabel was, afhankelijk van de verschillende elektrotonische afstanden van de somatische opnamelocatie naar het synaptische gebied waar elke mEPSC optreedt, en gebeurtenissen die afkomstig zijn van de soma of dendrieten presenteren zich respectievelijk als snel en langzaam stijgende gebeurtenissen (Han et al., 2013). In de huidige studie detecteerden we geen specifieke populaties van mEPSC's via de stijgtijd, en er werden geen criteria met betrekking tot de stijgtijd gebruikt om gedetecteerde gebeurtenissen verder te filteren. Dus, de mEPSC's en mIPSC's kunnen bestaan uit zowel proximale (d.w.z. somatische) als distale (dendritische) gebeurtenissen. In deze studie werden mEPSC's en mIPSC's geanalyseerd door het tweevoudige exponentiële vergelijkingsmodel in de Decay fit van MiniAnalysis-software. Deze methode werd aangepast aan een ensemble gemiddelde gegenereerd voor elke cel. De vergelijking is als volgt: y = A1∗e^(-x/t1) + A2∗e^(-x/t2). Signalen werden versterkt met een MultiClamp 700B-versterker (Molecular Devices, Union City, CA, Verenigde Staten), gefilterd op 2 kHz en gedigitaliseerd op 10 kHz. Gegevens werden geanalyseerd met het pCLAMP 10.3 gegevensverwervingsprogramma (Molecular Devices). Miniatuurgebeurtenissen werden offline gedetecteerd met MiniAnalysis (Synaptosoft), met de amplitude-threshold ingesteld op 5 pA en een gebied-threshold van 10.
Golgi-Cox Kleuring
Ratten werden verdoofd en transcardiaal geperfuseerd met 0,9% normale zoutoplossing. Hersenen werden ontleed en ondergedompeld in een Golgi-Cox-oplossing gedurende 2 weken op basis van eerdere studies (Yang et al., 2015; Han et al., 2016; Wang et al., 2017), en vervolgens in een 30% sucroseoplossing gedurende 2–5 dagen in het donker bij kamertemperatuur. Coronale secties (200 μm) werden bereid met behulp van een vibratoom (
(Microm HM 650V, Thermo Scientific, Walldorf, Duitsland) volgens eerdere studies (Yang et al., 2015; Wang et al., 2017). Dia's werden bewaard in het donker tijdens het kleuren en daarna.
Neuronen met duidelijke primaire dendrieten en uitsteeksels werden geselecteerd, wat de morfologische kenmerken zijn van BLA-hoofdneuronen (McDonald, 1982; Padival et al., 2013). We excludeerden aspiny-neuronen die kleine soma's vertoonden met weinig dendrieten of grote soma's met bipolaire primaire dendrieten. Een recente studie stelt dat de afstand van het soma invloed heeft op de rol van remmende schacht- en spine-synapsen en versterkt de rol van het axonale beginsegment (Boivin and Nedivi, 2018). Dus, in onze studie werden dendritische segmenten met een afstand van 50–150 μm van het soma (Christoffel et al., 2011), en een lengte van 40–70 μm, willekeurig gekozen uit piramidale neuronen in de BLA en werden geteld vanaf het begin van een tak. Tweede-orde apicale dendrieten werden geanalyseerd in onze studie. Om te voldoen aan de eisen van de analyse van wervelkolommen, moeten dendritische segmenten aan de volgende kwalificaties voldoen: segmenten moeten volledig zijn gevuld (met uitsluiting van alle uiteinden); segmenten moeten een afstand hebben van niet minder dan 50 μm van het soma; segmenten vertoonden geen overlap met andere takken, die de visualisatie van uitsteeksels zouden kunnen vervagen (Christoffel et al., 2011). Een 3D-beeld werd gereconstrueerd met NIH ImageJ-software. Het aantal dendritische uitsteeksels werd berekend op basis van de morfologie: dunne uitsteeksels hebben een dunne kop en een lange nek; paddenstoeluitsteeksels hebben een grote kop en een korte nek; stompe uitsteeksels hebben ook een grote kop maar geen duidelijke nek (Montalbano et al., 2013; Geoffroy et al., 2019). Voor morfologische kwantificering werd één dendriet per neuron en 5–8 neuronen per rat geanalyseerd in vijf ratten in elke groep. De onderzoeker was blind voor de groepering. Alle beelden werden vastgelegd met een Olympus BX53-microscoop met een 100× olie-immersie-objectief. Het gemiddelde aantal uitsteeksels per 10 μm dendriet werd berekend.
Statistische Analyse
Golfvormparameters (frequentie, amplitude, stijgtijd 10–90%, halve breedte, afbraaktijd 90–37% en gebied) (Hendrich et al., 2012) werden gemeten in de studie. De resultaten werden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Normale verdeling werd gevalideerd met de Shapiro–Wilks-test, en homogeniteit van variantie werd gevalideerd met de Levene's-test. Ongepaarde Student's t-test werd gebruikt voor vergelijkingen tussen twee groepen. Variantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt voor gegevensanalyse met geschikte tussen- en binnenproefpersonen. Bij het vergelijken van drie of meer groepen werd één- of tweeweg-ANOVA aangenomen met post-hoc-analyse (eenweg, Tukey; tweeweg, Sidak's multiple comparisons) voor vergelijking van drie of meer groepen. Cumulatieve waarschijnlijkheid werd vergeleken met behulp van Kolmogorov–Smirnov (KS)-statistieken (PKS). Aangezien grote steekproeven werden geanalyseerd, werd het significantieniveau meestal genomen bij PKS
Eerdere onderzoeken hebben aangetoond dat significante veranderingen in angstachtig gedrag alleen optraden bij ratten 10 dagen na SPS in plaats van 1 dag (Fang et al., 2018). Experiment 1 had tot doel veranderingen in angstachtig gedrag van ratten aan te tonen 1 en 10 dagen na SPS. Het experimentele protocol werd weergegeven in Figuur 1A. Normaal gezonde ratten werden 4-5 dagen apart gehouden om zich aan te passen aan de voedingsomgeving. Vervolgens ondergingen ratten in de experimentele groep het SPS-protocol (2 uur beperkt, 20 min gedwongen zwemmen, 15 min rust en verdoofd met ether tot bewusteloosheid), gevolgd door het apart houden in een kooi met ongestoorde voedingsomgeving. Angstachtig gedrag van ratten werd getest met de EPM en OFT op de eerste en tiende dag na SPS. Het experiment bestond voornamelijk uit 4 groepen: SPS(1d), NO SPS(1d), SPS(10d), NO SPS(10d) (n = 8 per groep). De resultaten van EPM en OFT werden geanalyseerd met two-way ANOVA, waarbij SPS (SPS, Geen SPS) en Post-SPS Dag (1 dag, 10 dagen) als tussen-onderwerpfactoren werden gebruikt. De analyse van de tijd besteed in de open arm in EPM toonde significante effecten van Post-SPS Dag (F1,28 = 7,92, p 0,05, Figuur 1E). Samenvattend tonen deze resultaten aan dat ratten een vertraagde aanvang van angstachtig gedrag vertonen na SPS, wat in lijn is met eerdere bevindingen (Knox et al., 2012a; Fang et al., 2018).
Vervolgens hebben we de synaptische mechanismen bestudeerd die ten grondslag liggen aan de uitgestelde ontwikkeling van angstachtig gedrag na SPS. Ons eerdere onderzoek toonde aan dat de activiteit van BLA-glutamaterge neuronen en BLA-GABAerge neuronen dag 10 na SPS toenam in vergelijking met de controlegroep (Fang et al., 2018). De BLA bestaat voornamelijk uit glutamaterge piramidale neuronen (~85%) (Duvarci en Pare, 2014). Dendrieten in de amygdala zijn bijzonder gevoelig voor stressblootstelling (Chattarji et al., 2015). Daarom hebben we de tijdafhankelijke veranderingen in de dichtheid van dendritische uitsteeksels in de BLA in het SPS-model geanalyseerd (Figuur 2A,B). Het experiment bestond uit vier groepen (n = 5 per groep). De resultaten van de uitsteeksel dichtheid werden geanalyseerd met two-way ANOVA, waarbij SPS (SPS, Geen SPS) en Post-SPS Dag (1 dag, 10 dagen) als tussen-onderwerpfactoren werden gebruikt. De analyse toonde opvallende effecten aan van SPS (F1,16 = 6,74, p 0,05). Post-hoc-analyse toonde aan dat de dichtheid van paddenstoelvormige uitste
eksels opvallend toenam in de SPS(10d)-groep (p 0,05, Figuur 2D). Dichtheid van stompe uitsteeksels, die werden beschouwd als onrijpe structuren en een zekere relatie hadden met de stress-geïnduceerde toename van glutamaterge synapsen, nam zowel op dag 1 als op dag 10 na SPS toe in vergelijking met de overeenkomstige controlegroepen (beide p
Vorming en eliminatie van dendritische uitsteeksels kunnen bijdragen aan synaptische connectiviteit en functie, waarbij vooral paddenstoelvormige uitsteeksels positief correleren met synapssterkte en leeftijd (Holtmaat en Svoboda, 2009; Moench en Wellman, 2015). Daarom hebben we, na het volgen van dezelfde SPS-procedure, mIPSCs en mEPSCs van dezelfde cel geregistreerd bij verschillende voltages in de SPS(1d)- en SPS(10d)-groepen, respectievelijk om spontane kwantitatieve synaptische invoer op BLA-piramidale neuronen te bepalen (Figuur 3, 4). Voor de ingangweerstand was er geen significant verschil tussen de experimentele omstandigheden (p > 0,05, Supplementary Figure S2A). Gegevens van de frequentie en amplitude van mEPSCs en mIPSCs werden geanalyseerd met one-way ANOVA, waarbij SPS als tussen-onderwerpfactor werd gebruikt (n = 13-18 cellen per groep). De mEPSC-frequentie opgenomen in BLA-piramidale neuronen van de SPS(10d)-groep was opmerkelijk verhoogd in vergelijking met de NO SPS-groep (F1,29 = 20,93, p 0,05, Figuur 3D). Voor de mEPSC inter-event intervallen van BLA-piramidale neuronen was de cumulatieve waarschijnlijkheidsverdeling van de SPS(10d)-groep naar links verschoven in vergelijking met de NO SPS-groep (PKS 0,05, Figuren 3F,L). De cumulatieve waarschijnlijkheidsverdeling van amplitudes van mEPSCs in BLA-piramidale neuronen van SPS(1d) en SPS(10d) groepen verschilde niet vergeleken met NO SPS-piramidale neuronen (beide p > 0,05, Figuren 3E,K). Ten slotte hebben we de amplitude en frequentie van mEPSCs vergeleken in BLA-piramidale neuronen van de SPS(1d)-groep en de SPS(10d)-groep. De excitatoire synaptische frequentie van piramidale neuronen van de SPS(10d)-groep was verhoogd in vergelijking met die van de SPS(1d)-groep (F1,30 = 9,18, p 0,05, Tabel 1). De resultaten toonden aan dat de amplitude van mEPSCs van BLA-piramidale neuronen na SPS niet duidelijk werd beïnvloed, maar de frequentie van mEPSCs in BLA-piramidale neuronen nam significant toe op dag 10 na SPS. Ten slotte hebben we, aangezien grotere uitsteeksels vaak grotere mEPSC-amplitude voorspellen (Segal, 2010; Ueno et al., 2014), de mEPSCs geanalyseerd na het classificeren van spikes in verschillende subgroepen op basis van verschillende amplitude-waarden (Lu et al., 2007; Biggs et al., 2010). One-way ANOVA analyseerde de gebeurtenissen met grote amplitude (>30 pA) van mEPSCs in BLA-piramidale neuronen van de vier groepen, de resultaten toonden aan dat de gebeurtenissen met grote amplitude (>30 pA) van mEPSCs in BLA-piramidale neuronen van de SPS(10d)-groep waren toegenomen in vergelijking met controlegroepen (F3,45 = 4,16, p
We hebben ook de mIPSCs (miniatuur-inhiberende postsynaptische stromingen) van dezelfde piramidale neuronen geregistreerd, gekoppeld aan mEPSCs (miniatuur-excitatorische postsynaptische stromingen) na de SPS-procedure (Calfa et al., 2015) met 1 μM TTX (Figuur 4) bij 0 mV (n = 13-18 cellen per groep). De frequentie van mIPSCs opgenomen in BLA-piramidale neuronen 1 dag na SPS vertoonde geen veranderingen in vergelijking met de controlegroepen (p > 0,05, Figuur 4D), terwijl de SPS(10d)-groep een aanzienlijk hogere frequentie van mIPSCs liet zien dan de controlegroepen (F1,29 = 11,60, p 0,05, Figuren 4F, L). In BLA-piramidale neuronen werden de curves van de cumulatieve waarschijnlijkheidsverdeling van de amplitude van mIPSCs van de SPS(1d)-groep en de SPS(10d)-groep niet verschoven in vergelijking met controlepiramidale neuronen en ze vielen bijna samen (beide p > 0,05, Figuren 4E, K). Vervolgens hebben we de amplitude en frequentie van mIPSCs vergeleken in BLA-piramidale neuronen van de SPS(1d)-groep en de SPS(10d)-groep, en de analyse toonde aan dat de remmende synaptische frequentie van BLA-piramidale neuronen van de SPS(10d)-groep duidelijk hoger was dan die van de SPS(1d)-groep (F1,30 = 3,51, p > 0,05, Tabel 1), en er werden geen veranderingen waargenomen in amplitude (p > 0,05, Tabel 1). Samengevat toonden de resultaten aan dat de inhiberende synaptische transmissie van BLA-piramidale neuronen toenam op dag 10 na SPS. De resultaten toonden aan dat BLA-piramidale neuronen verbeterde inhiberende neuronale projecties ontvingen op dag 10 na SPS, en de frequentie van zowel mEPSCs als mIPSCs nam toe.
Discussie
Patiënten met PTSS hebben typisch symptomen zoals vermijding, verstoring en ontwaken, emotionele en cognitieve veranderingen (Pitman et al., 2012). Er zijn uitgebreide rapporten die de SPS-procedure hebben gebruikt om het PTSS bij dieren te bestuderen (Iwamoto et al., 2007; Wen et al., 2016; Fang et al., 2018). Onderzoek heeft aangetoond dat SPS leidt tot verminderde angstuitdoving (Knox et al., 2012a; Fang et al., 2018), verhoogde stressgeïnduceerde nociceptieve gevoeligheid en toegenomen angstachtig gedrag (Zhang et al., 2012), en SSRI kan de symptomen omkeren (Takahashi et al., 2006; Lin et al., 2016). We hebben PTSS-geïnduceerd angstachtig gedrag beoordeeld via OFT en EPM. Onze gedragsexperimenten toonden geen opmerkelijke veranderingen in het angstachtige gedrag van ratten op de eerste dag na SPS, maar een significante toename die consistent is met eerdere bevindingen op de tiende dag na SPS (Fang et al., 2018). Bovendien ontdekten we vertraagde veranderingen in synaptische plasticiteit in BLA-piramidale neuronen na SPS. Specifiek, op dag 10 na blootstelling aan SPS, wees het resultaat op een toename in de dichtheid van dendritische uitsteeksels, evenals een versterking van zowel glutamaterge als GABAerge synaptische transmissies. Kortom, SPS veroorzaakte een vertraagde toename van spinogenese en synaptische transmissie in de BLA, wat gepaard ging met versterkt angstachtig gedrag.
De structurele plasticiteit van dendritische uitsteeksels is cruciaal voor diverse vormen van synaptische plasticiteit (Yang et al., 2009; Yin et al., 2009; Oe et al., 2013), inclusief structurele hermodellering als reactie op stress (Chattarji et al., 2015; Duman en Duman, 2015; Qiao et al., 2016). De structurele basis van synaptische connectiviteit in de BLA wordt differentieel gemodificeerd door verschillende vormen van stress (Chattarji et al., 2015). Acute beperkende stress induceert een toename van de dichtheid van dendritische uitsteeksels in de BLA-piramidale neuronen enkele dagen na stress (Mitra et al., 2005; Maroun et al., 2013; Suvrathan et al., 2014; Yasmin et al., 2016). Chronische beperkende stress veroorzaakt dendritische hypertrofie in BLA-piramidale neuronen, een toename van de grootte van de kop van dendritische uitsteeksels (Mitra et al., 2005; Vyas et al., 2006; Maroun et al., 2013; Zhang et al., 2019) en verbeterde neuronale prikkelbaarheid (Rosenkranz et al., 2010). In overeenstemming hiermee toonden onze resultaten aan dat de dichtheid van dendritische uitsteeksels in BLA-piramidale neuronen van de SPS(10d)-groep was toegenomen. Een recente studie toonde echter aan dat acute stress opgeleverde platform de dichtheid van paddenstoelvormige uitsteeksels verhoogde en dendritische intrekking veroorzaakte in BLA-piramidale neuronen 2 dagen later (Maroun et al., 2013). We vermoeden dat de tegenstrijdigheden tussen de bevindingen over de effecten van stress op de dendritische morfologie van de amygdala te wijten kunnen zijn aan verschillende soorten en procedures van stress. De huidige resultaten toonden aan dat paddenstoelvormige uitsteeksels, maar niet dunne uitsteeksels, een vertraagde toename vertoonden na SPS. Over het algemeen hebben dunne uitsteeksels een hogere plasticiteit en labiliteit vergeleken met paddenstoelvormige uitsteeksels (Moench en Wellman, 2015). Dus suggereren onze resultaten dat het volwassen en stabiele type uitsteeksels geleidelijk toeneemt na traumatische stress, wat mogelijk de structurele ondergrond is van het vertraagde begin van angstachtig gedrag. Terwijl de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vertraagde veranderingen in dendritische uitsteeksels onduidelijk blijven, is het vermeldenswaardig dat de implicaties van NMDA- en AMPA-receptoren bij de regulatie van structurele plasticiteit (Krugers et al., 2010; Duman, 2014; Yasmin et al., 2016) belangrijk zijn. NMDA-receptoren worden beschouwd als betrokken bij de initiële vorming van uitsteeksels door calciuminflux en continue effecten stroomafwaarts (Maletic-Savatic et al., 1999), en AMPA-receptoren worden geassocieerd met het versterken van bestaande uitsteeksels (Maletic-Savatic et al., 1999). In de amygdala konden 10 dagen chronische immobilisatiestress NMDAR-gemedieerde synaptische reacties verbeteren (Suvrathan et al., 2014), en de NMDAR-antagonist toegediend in de BLA tijdens de acute stress voorkwam de versterkte effecten op de frequentie van mEPSCs en de dichtheid van dendritische uitsteeksels 10 dagen later (Yasmin et al., 2016). Het is aangetoond dat het aantal GluA1-AMPAR-gelabelde uitsteeksels in de BLA na stress 6 en 14 dagen, maar niet 1 dag na stress, toeneemt, wat gepaard gaat met een verhoogde frequentie van mEPSCs in gestreste dieren zonder veranderingen in amplitude van mEPSCs (Hubert et al., 2014). Daarom speculeren we dat AMPA-receptoren geassocieerd zijn met de expressie en het behoud van door stress geïnduceerde structurele plasticiteit, terwijl NMDA-receptoren belangrijk zijn voor het initiëren van door stress geïnduceerde structurele plasticiteit. Interessant genoeg vonden we dat de stompe uitsteeksels zowel op dag 1 als op dag 10 na traumatische stress waren toegenomen. Een stompe uitsteeksel met een grote kop en geen hals wordt beschouwd als een type onvolwassen uitsteeksels (Ebrahimi en Okabe, 2014; Berry en Nedivi, 2017). Hoewel er weinig bekend is over de structuur van stompe uitsteeksels, is gemeld dat ze overheersen in de vroege postnatale ontwikkeling (Boyer et al., 1998) en prolifereren in de nucleus accumbens na sociale stress (Christoffel et al., 2011). Gezien de rollen van de geometrie van de uitsteekselhals bij synaptische plasticiteit, kunnen stompe uitsteeksels een sterk signaal genereren dat diffundeert door de omringende dendriet (Hayashi en Majewska, 2005; Ebrahimi en Okabe, 2014), wat betrokken zou kunnen zijn bij angstachtig gedrag. De precieze rollen van stompe uitsteeksels bij structurele plasticiteit in de amygdala en maladaptieve reactie op stress moeten verder worden onderzocht.
Uitsteeksels zijn belangrijke doelen voor excitatorische synaptische transmissie (Harris en Kater, 1994; Qiao et al., 2016) en zijn positief geassocieerd met synaptische transmissie (Hayashi en Majewska, 2005; Alvarez en Sabatini, 2007; Ebrahimi en Okabe, 2014). In ons huidige onderzoek toonde de analyse van de frequentie van mEPSCs een vertraagde verbetering in BLA na SPS, wat overeenkomt met de bevindingen dat een verhoogd aantal excitatoire piramidale neuronen werd geactiveerd op de tiende dag na SPS (Fang et al., 2018). Consistent met Yasmin en collega's vonden we dat een toename in de frequentie van mEPSCs die werd veroorzaakt door stress geassocieerd was met een verhoging van het aantal dendritische uitsteeksels (Yasmin et al., 2016). Een toename in de frequentie van mEPSCs wordt beschouwd als te wijten aan een toename van het aantal glutamaterge synapsen en een presynaptische onderdrukking van de waarschijnlijkheid van glutamaatafgifte (Malgaroli en Tsien, 1992; Sastry en Bhagavatula, 1996). Gezien de aanzienlijke toename van het aantal dendritische uitlopers in de BLA in de SPS (10d) groep, zou de waargenomen verbetering van de frequentie van mEPSCs in onze studie mogelijk, althans gedeeltelijk, veroorzaakt kunnen worden door de toename van het aantal functionele excitatoire synapsen. Onder bepaalde omstandigheden hebben sommige andere studies gemeld dat een toename van het aantal dendritische uitlopers gepaard gaat met een verbetering van de frequentie van mEPSCs (Wissman et al., 2011; Montalbano et al., 2013; Bochner et al., 2014; Yasmin et al., 2016; Schilling et al., 2017; Sun et al., 2018). Echter, het verhoogde aantal uitlopers, met name grote uitlopers, zou voorspellend zijn voor een toename van de expressie van postsynaptische excitatoire receptoren en bijgevolg grotere mEPSCs-amplitude (Lee et al., 2015; Udagawa et al., 2015; Awad et al., 2016; Deng et al., 2019). In overeenstemming hiermee toonden we aan dat de amplitude (>30 pA) van mEPSCs in BLA-pyramidecellen van de SPS (10d) groep was toegenomen in vergelijking met de groepen zonder SPS, wat overeenkomt met de waargenomen toename van de dichtheid van paddestoelvormige uitlopers op de 10e dag na SPS.
Bron
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6824323/pdf/fpsyg-10-02394.pdf
Traumatic Stress Produces Delayed Alterations of Synaptic Plasticity in Basolateral Amygdala - PMC (nih.gov) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6824323/
